MIKROBIOLOGI PANGAN

I.                   LATAR BELAKANG

1.1 Latar Belakang

Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang mikroba. Mikrobiologi adalah salah satu cabang dari ilmu biologi, dan memerlukan ilmu pendukung kimia, fisika, dan biokimia. Mikrobiologi sering disebut dengan ilmu praktek dari biokimia. Dalam mikrobiologi dasar memiliki pengertian tentang sejarah penemuan mikroba, macam-macam mikroba di alam, struktur sel mikroba dan fungsinya, metabolism mikroba secara umum, pertumbuhan mikroba dan factor lingkungan, mikrobiologi terapan di bidang pangan, lingkungan dan pertanian. Mikroorganisme sangat erat kaitannya dengan kehidupan kita, beberapa dianyaranya bermanfaat dan yang lain merugikan. Beberapa mikroorganisme menyebabkan penyakit dan yang lain terlibat dalam kegiatan manusia sehari-hari seperti dalam pembuatan anggur, keju, yogurt, produksi penisilin dan sebagainya.

Bahan pangan merupakan salah satu kebutuhan manusia tak terkecuali bagi mikroorganisme. Kalau bahan makanan telah tercemar oleh mikroorganisme, mikroorganisme tersebut dapat menyebabkan kerusakan bahan pangan, yakni terjadinya perubahan fisik dan kimia dari bahan tersebut. Hal ini menyebabkan mutu pangan menjadi turun. Selain itu mikroba juga dapat menimbulkan penyakit  bagi manusia yang mengkonsumsi bahan pangan yang telah tercemar oleh mikroba.

Berbagai macam uji mikrobiologi dapat dilakukan terhadap bahan pangan meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan mutu dan daya tahan suatu makanan, uji kualitatif bakteri pathogen untuk menentukan tingkat keamanannya dan uji bakteri indikator untuk menentukan tingkat sanitasi makanan tersebut. Pengujian yang dilakukan terhadap setiap bahan pangan tidak sama tergantung dari berbagai faktor seperti jenis dan komposisi bahan pangan, cara pengepakan dan penyimpanan, cara penanganan dan konsumsinya, kelompok konsumen dan berbagai faktor lainnya.

Produk hasil peternakan seperti susu dan produk hasil pertanian seperti sayur dan buah-buahan memiliki nutrisi yang dapat dimanfaatkan oleh untuk pertumbuhan mikroorganisme Infeksi mikroorganisme terhadap produk dapat terjadi semasih buah-dan sayuran tersebut tumbuh dilapangan, namun mikroorganisme tersebut tidak tumbuh dan berkembang, hanya berada di dalam jaringan. Bila kondisinya memungkinkan terutama setelah produk tersebut dipanen dan mengalami penanganan dan penyimpanan lebih lanjut, maka mikroorganisme tersebut segera dapat tumbuh dan berkembang dan menyebabkan pembusukan yang serius.

Mikroorganisme yang menyebabkan kebusukan pada sayuran dapat diketahui dengan melakukan uji mikrobiologi. Metode yang dapat digunakan untuk menentukan jumlah mikroba di dalam bahan pangan terdiri dari metoda hitung cawan (HC), Most Probable Number (MPN), dan metode hitung mikroskopis langsung.

1.2 Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk mengamati dan menghitung total mikroba pada bahan pangan dengan sampel yang digunakan adalah susu, telur dan sayur yang telah busuk. Selanjutnya dilakukan pewarnaan untuk mengetahui jenis bakteri yang mengkontaminasi bahan pangan tersebut. Selain itu pengujian daya tahan mikroba terhadap panas yang dilakukan pada tiga metode yang berbeda yaitu pasteurusasi, sterilisasi dan sterilisasi absolut. 

II.                TINJAUAN PUSTAKA

2.1  Mikrobiologi Pangan

              Mikrobilogi pangan adalah ilmu yang mempelajari pengaruh proses pengolahan terhadap  sel mikroorganisme, termasuk mekanisme ketahanan mikroorganisme terhadap proses pengolahan. Disamping itu, ilmu mikrobiologi pangan merupakan ilmu yang juga mempelajari perubahan-perubahan yang merugikan seperti kebusukan dan keracunan makanan, maupun perubahan-perubahan yang menguntungkan seperti dalam fermentasi makanan. Proses pengolahan dan pengawetan makanan tidak sepenuhnya dapat mencegah semua perubahan-perubahan yang merugikan. Contonya, pada makanan-makanan  yang telah diawetkan dengan pembekuan atau pengeringan, enzim-enzim yang terdapat di dalam bahan pangan masih mungkin aktif dan menyebabkan perubahan warna, tekstur maupun citarasa dari suatu produk pangan. Hal ini menunjukkan sebelum produk pangan mengalami proses pembekuan atau pengerimngan sebaiknya dilakukan  proses pendahuluan dengan pemanasan, seperti blansir, yang berguna untuk menginaktifkan enzim-enzim yang terdapat di dalam bahan pangan mentah.

Ketahanan mikroorganisme maupun enzim-enzim yang terdapat di dalam sel mikroorganisme berbeda terhadap berbagai proses pengawetan dan pengolahan. Contohnya, penyimpanan makanan pada suhu rendah pada umumnya dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme, tetapi suhu penyimpanan tersebut bahkan dapat merangsang pertumbuhan mikroorganisme yang tergolong psikrofilik yang dapat menyebabkan kebusukan makanan. begitu juga dengan penambahan garam pada umumnya dapat menghambat kebanyakan mikroorganisme, tetapi dapat merangsang pertumbuhan bakteri halofiilik yang sering mengakibatkan perubahan warna.

Tidak saja ketahanan mikroorganisme dalam bahan pangan yang berbeda, karakteristik dalam masing-masing produk pangan adalah berbeda, dimana sifat tersebut akan mempengaruhi komposisi dari bahan pangan, cara pengolahan, dan kondisi penyimpananannya. Hal ini menunjukkan bahwa sifat mikrobiologi pada setiap produk berbeda dan sangat spesifik.

2.2 Faktor Penyebab Pertumbuhan Mikroba Dalam Bahan Pangan

2.2.1 Faktor Intrinsik (Sifat Bahan Pangan)

Faktor–faktor intrinsik atau faktor dalam  yang dapat mempengaruhi populasi mikroorgannisme didalam makanan meliputi sifat-sifat kimia atau komposisi, sifat fisik dan struktur makanan. Faktor ini meliputi nilai  aktivitas aira(Aw), komposisi nutrien, pH, potensial redoks, adanya bahan pengawet alamiah atau tambahan dan sebagainya.

Ø  Aktivitas Air (aw= water activity)

Nilai aktivitas air untuk beberapa bahan makanan dan jenis  mikrooganisme khusus yang terdapat didalamnya kan berbeda untuk setiap jenis bahan makanan. Bahan makanan dengan kadar air tinggi ( nilai aw: 0,95 – 0,99) umumnya dapat ditumbuhi oleh semua jenis mikroorganisme dan biasanya kerusakan akan lebih banyak karena bakteri dapat tumbuh lebih cepat dibandingkan dengan kapang dan khamir.

Ø  Nilai pH

Umumnya nilai pH bahan makanan berkisar antara 3,0 sampai 8,0. Kebanyakan  mikroorganisme tumbuh pada pH sekitar 5,0 sampai 8,0 dan hanya jenis-jenis tertentu saja mikroorganisme yang ditemukan pada bahan makanan dengan pH yang lebih rendah.

Ø  Potensial Redoks

Potensial redoks dari suatu sistem biologis adalah suatu sistem indeks dari tingkat oksidasinya. Bahan makanan dengan potensial redoks yang tinggi akan membantu pertumbuhan dari jenis-jenis mikroorganisme yang bersifat aerobik seperti Pseudomonas.

Ø  Zat-zat Gizi

Komposisi bahan makanan dapat menentukan jenis mikroorganisme yang dominan didalamnya, karena hal ini akan menentukan jenis zat gizi yang penting tersedia untuk perkembangan mikroorganisme. Bahan makanan dengan gizi yang cukup akan membantu pertumbuhan mikrooragnisme seperti, Lactobacillus yang membutuhkan banyak zat gizi.

Ø  Bahan Anti Mikrobial Alamiah

Bahan anti mikroba dapat diperoleh secara alamiah pada bahan-bahan makanan seperti minyak essensial dan tanin pada bahan makanan asal tumbuh-tumbuhan dan lizozyme serta avidin pada bahan makanan dari hewani seperti telur.

Ø  Struktur Biologis

Strukutr biologis seperti lapisan kulit telur, kutikula dari bagian tanaman berguna untuk mencegah masuknya mikroorganisme kedalam bahan makanan.

2.2.2  Faktor Pengolahan

Faktor pengolahan ini akan mempengaruhi jumlah mikroorganisme yang dominan dalam bahan makanan yang telah diolah atau diawetkan. Proses pengolahan seperti pemanasan atau irradiasi dapat membunuh sebagian atau seluruh mikroorganisme, terutama  mikroorganisme yang tidak tahan terhadap panas dan irradiasi.

            Pengeringan dan pembekuan bahan makanan dapat mengakibatkan kerusakan pada mikroorganisme yang terdapat didalamnya. Tetapi beberapa jenis mikroorganisme yang tahan terhadap perlakuan tersebut akan tetap dapat hidup dan dapat menyebabkan kerusakan bila bahan makanan tersebut dicairkan.

2.2.3 Faktor  Ekstrinsik (Lingkungan)

Bahan pangan segar atau makanan olahan yang tidak langsung dikonsumsi memerlukan tahap penyimpanan atau transpor/distribusi. Faktor-faktor yang mempengaruhui penyimpanan dan transpor seperti suhu, kelembaban dan susunan gas, merupakan faktor lingkungan (ekstrinsik) yang mempengaruhi populasi jasad renik yang terdapat pada makanan.

2.2.4 Faktor Implisit

            Berbagai mikroba yang terdapat pada bahan makanan kadang-kadang mengakibatkan dua atau lebih jenis mikro organisme hidup bersama saling menguntungkan (sinergisme) atau sebaliknya yang satu merugikan  pertumbuhan jenis mikrorganisme yang lain (antagonisme).

2.2.5 Faktor Makanan

1.  Makanan yang mudah rusak, yaitu  yang  mempunyai  aktivitas  air (aw),  dan  pH  yang relatif  tinggi  (pH>5,3),  misalnya :  daging , daging ayam, ikan ,susu dan sebagainya.

2.   Makanan yang  agak  awet,  yaitu   makanan  yang  mempunyai  pH  pertengahan   (antara 4,5 sampai 6,3 )  atau  telah  mengalami  proses  pengawetan  sehingga kadar airnya menjadi agak rendah, misalnya: jam, jeli, susu kental manis, acar, sosis terfermentasi  dan sebagainya.

3.   Bahan  makanan  yang  awet  (tahan lama disimpan)  yaitu makanan  yang  telah    diawetkan dengan pengeringan sehingga kadar airnya (aw) rendah, misalnya   dendeng,  abon,  ikan asin     dan sebagainya.

 

2.3 Pengaruh Proses Pengolahan terhadap Mikroorganisme

2.3.1 Pengaruh Pemanasan Terhadap Mikroorganisme

            Untuk mengendalikan pertumbuhan dan kegiatan mikroba dapat dilakukan dengan menggunakan perlakuan suhu tinggi. Pada perlakuan suhu diatas suhu maksimum pertumbuhan mikroba akan bersifat mematikan dan semakin tinggi suhunya akan semakin tinggi laju kematiannya.

2.3.2 Pengaruh Pembekuan Terhadap Mikroorganisme

Mikroorganisme dapat diklasifikasikan atas dasar suhu optimum yang berguna untuk pertumbuhannya. Umumnya mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada suhu dibawah 32⁰F, tetapi ada beberapa jenis khamir yang  masih bisa tumbuh dalam substrat tidak beku pada suhu dibawah 15⁰F. Pendinginan yang lambat dapat merusak populasi mikroba dan bentuk mikrobia yang sangat peka adalah sel-sel vegetatif, sedangkan spora biasanya tidak rusak oleh pembekuan.

2.3.3 Pengaruh Pengeringan Terhadap Mikroorganisme

Proses pengeringan dalam pengolahan bahan makanan merupakan proses pembatasan air yang digunakan untuk pertumbuhan  oleh mikroorganisme. Hal ini akan menentukan jumlah dan jenis dari mikroorganisme untuk tumbuh dalam bahan makanan tersebut.

2.3.4 Pengaruh Pengolahan dengan Garam, Asam, dan Bahan Kimia Pengawet terhadap Mikroorganisme

Pengolahan dengan Garam dan Asam

Garam akan sangat berpengaruh bila dimasukan kedalam bahan makanan karena garam akan dapat merobah rasa dari makanan dan juga dapat  menghambat pertumbuhan mikroorganisme pencemar pada bahan makanann terutama mikroorganisme proteolitik dan pembentuk spora walaupu dengan kadar yang sangat rendah (sampai 6%).

Pengolahan bahan makanan dengan pemberian garam/ NaCl konsentrasi tinggi dapat mencegah kerusakan dari bahan tersebut. Mikroorganisme psikrofilik dapat dicegah pertumbuhannya dengan pemberian NaCl pada konsetrasi 2-5 % dan dikombinasikan dengan suhu rendah.

 Pengolahan dengan Gula

            Penggunaan  gula dalam pengolahan bahan makanan akan mempengaruhi mikroorganisme yang terdapat dalam bahan makanan tersebut, terutama bila dalam konsentrasi yang tinggi(minimal 40% padatan terlarut).Hal ini akan mengakibatkan air yang ada dalam bahan makanan tidak tersedia untuk pertumbuhan mikroorganisme sehingga kadar airnya menjadi rendah dan keadaan inilah yang menyebabkan mikroorganisme tidak mampu untuk melakukan aktifitas hidupnya.

 Pengolahan dengan Bahan Pengawet Kimia

Penggunaan bahan kimia pengawet dalam bahan makanan dapat menghambat atau menghentikan aktivitas mikroorganisme baik bakteri, kapang dan khamir. Biasanya bahan kimia pengawet yang digunakan bersifat bakteriostatik karena hanya dipakai dalam jumlah kesil sehingga tidak membahayakan bagi konsumennya.

 Pengaruh Radiasi dalam Pengawetan Terhadap Mikroorganisme

Penggunaan radiasi dalam pengolahan bahan makanan bisa mempengaruhi ketahahan dari mikroorganisme. Radiasi yang digunakan ada dua macam yaitu: radiasi panas yang merupakan radiasi yang menggunakan sinar dengan gelombang yang panjang  dan radiasi ionisasi yang merupakan radiasi yang menggunakan sinar gelombang yang pendek.

2.4 Produk Pertanian (Sayur-sayuran)

              Beberapa indicator mikroorganisme pembusuk pada bahan pangan adalah bakteri yang tergolong ke dalam bakteri koliform, bakteri ini hampir ada pada setiap bahan pangan yang telah mengalami  tahap  pengolahan. Splittstoesser dan Wettergreen (1981) melakukan pengamatan terhadap beku, melaporkan adanya Enterobacter dan Klebsiella pada sayur-sayuran sejak masih di kebun yang merupakan mikroflora normal. Sehingga, mikroorganisme ini tidak dapat dijadikan sebagai indicator sanitasi. Sedangkan terkontaminasinya sayuran oleh koliform fekal seperti Escheria coli yang sebenarnya jarang ditemukan pada sayuran dapat menjadikan bakteri ini sebagai mikroorganisme indicator sanitasi pada sayuran.

              Sayuran segar lebih banyak terkontaminsasi E.coli dibandingkan dengan sayuran beku. Hal ini disebabkan oleh beberapa hal, yaitu: 1) Sayuran jarang terkontaminasi oleh kotoran manusia maupun hewan, kecuali jika setelah pemanenan sayuran dicuci dengan air yang terkontaminasi kotoran. 2) Sayuran bukan termasuk ke dalam habitat normal E.coli. 3)  Kemingkinan terjadi kontaminasi kotoran maupun koliform fekal pada sayuran, tetapi E.coli merupakan bakteri yang sensitive terhadap proses blansir dan pembekuan sehingga tidak akan terdeteksi pada produk sayuran beku.

              Untuk sayuran kaleng yang merupakan sayuran yang diproses dengan cara sterilisasi komersial di dalam kaleng sehingga diharapkan sayuran tersebut sudah terbebas dari mikroorganisme pathogen dan pembusuk yang dapat tumbuh selama penyimpanan pada suhu simpan yang normal.  Pengujian untuk kualitas keamanan makanan kaleng yang terutama adalah Clostridium botulinum. Bakteri ini tergolong bakteri anaerobic yang membentuk spora dan bersifat mesofilik, dan juga merupakan bakteri pembentuk neurotoksin yang dapat mengakibatkan keracunan yang bersifat fatal. Untuk pengujian terhadap mikroorganisme indicator sanitasi ini yang paling sering dilakukan terhadap makanan kaleng.

Cemaran akan semakin tinggi pada bagian tanaman yang ada di dalam tanah atau dekat dengan tanah. Mikroba tertentu seperti Liver fluke dan Fasciola hepatica akan berpindah dari tanah ke selada air akibat penggunaan kotoran kambing atau domba yang tercemar sebagai pupuk. Air irigasi yang tercemar Shigella sp., Salmonella sp., E. coli, dan Vibrio cholerae dapat mencemari buah dan sayur. Selain itu, bakteri Bacillus sp., Clostridium sp., dan Listeria monocytogenes dapat mencemari buah dan sayur melalui tanah. Namun, penanganan  dan pemasakan yang baik dan benar dapat mematikan bakteri patogen tersebut, kecuali bakteri pembentuk spora (Djaafar, 2007). 

Tabel 1. Kajian tentang tingkat cemaran mikroba pada sayuran di Jawa Barat dan Jawa Timur

 

Persyaratan kontaminasi bakteri dalam bahan pangan berdasarkan BPOM (Badan Pengawasan Obat dan Makanan, 2004). Kisaran batas maksimum kontaminasi mikroba pada produk pangan terdapat pada Tabel berikut.

Tabel 2 . Batas maksimum cemaran mikroba pada produk pangan

 

2.5 Produk Hasil Peternakan

Daging dan Unggas

              Pengujian mikroorganisme indicator pada produk daging merah dan daging unggas biasanya dilakukan untuk beberapa tujuan seperti: 1) Menjamin keamanan produk pangan secara mikroorganisme biologis, 2) Mengetahui kondisi sanitasi selama pengolahan, dan 3)  Mengetahui daya awet dari produk pangan. Alasan dari pengguanaan indicator adalah untuk memantau mutu bahan mentah yang digunakan, kondisi pengolahan, dan mutu produk pada berbagai tahap pengolahan dan distribusi. Beberapa mikroorganisme indicator pada daging merah dan unggas dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Mikroorganisme Indikator pada Produk Daging dan Unggas

Indikator	Mikroorganisme
Keamanan	Salmonella
	Staphylococcus aureus
	Clostridium perfringens
	Clostridia mesofilik
Sanitasi	Total hitungan cawan aerobik pada suhu 35-37°C
	Kokiform
	Eschericia coli
	Enterokoki
Daya tahan simpan	Total hitungan cawan aerobik pada suhu 4-10°C dan 20-30°C
	Kapang dan khamir
	Bakteri asam laktat (BAL)
	Pseudomonad

Makanan Kaleng

              Makanan kaleng adalah produk olahan pangan yang sudah diawetkan agar tahan lama. Di dalam bukunya yang sangat terkenal, Thermobacteriology in Food Processing, Prof. Dr. C.R. Stumbo mengatakan bahwa makanan yang dikalengkan secara hermitis (penutupannya sangat rapat, sehingga tidak dapat ditembus oleh udara, air, mikrobia atau bahan asing lain) merupakan produk teknologi pengawetan yang sudah lama dikenal.        Makanan yang diawetkan dengan proses sterilisasi komersial, masih mengandung mikroba tetapi tidak dapat tumbuh pada kondisi penyimpanan yang normal.

              Proses sterilisasi ini merupakan upaya penghancuran mikroba patogen
beserta sporanya. Karena ada spora bakteri tertentu yang tahan terhadap suhu tinggi, sterilisasi harus dilakukan pada suhu 2500F (1210C) dengan menggunakan uap panas (autoklav) selama 15 menit. Produk selanjutnya ditutup secara hermitis sehingga tidak memberi kesempatan mikroba masuk kembali. Lamanya pemanasan dan tingginya suhu sangat tergantung pada derajat keasaman (pH) produk. Semakin rendah pH produk, misalnya sari buah, makin rendah suhu pemanasan yang digunakan.

              Penurunan mutu makanan kaleng bergantung pada sifat bahan, suhu sterilisasi dan kondisi udara dalam head space-nya. Semakin lama disimpan, semakin rendah daya simpannya (shelf life loss). Kemunduran daya simpan ini disebut kadaluwarsa. Bila menggunakan bahan baku yang baik, proses pemanasan sempurna dan bahan pengemas yang tidak berbahaya, maka daya simpan makanan kaleng dapat mencapai tiga tahun. Makanan kaleng biasanya tidak menuntut kondisi penyimpanan tertentu, dalam arti dapat disimpan pada suhu kamar dan di segala tempat. Namun, penyimpanan pada suhu rendah dan kering dapat memperpanjang masa simpan. Di sisi lain penyimpanan pada tempat yang lembab dan basah dapat melahirkan proses pengkaratan yang tidak diinginkan.

              Kerusakan yang lain dapat terjadi karena kurang sempurnanya pengolahan. Misalnya, selama proses sterilisasi, terjadi kebocoran kecil pada sambungan kaleng yang menggelembung, tetapi kemudian tertutup kembali setelah pendinginan. Bila dalam proses pendinginannya digunakan air kurang bersih, dapat dipastikan mikroba pembusuk akan hadir dalam kaleng melalui lobang kecil tersebut. Pada gilirannya, bila kondisi penyimpanan mendukung maka bakteri tersebut akan tumbuh dan berkembang biak dan kelak memproduksi racun.

              Ada beberapa hal yang harus diwaspadai supaya kita terhindar dari toksin (racun) Clostridium botulinum  yang merupakan mikroorganisme indikoator keamanan  dalam makanan kaleng yang kerap kali hadir. Bakteri yang berbahaya ini umumnya menyukai tempat-tempat yang tidak ada udara (anaerobik) dan mampu melindungi diri dari suhu yang agak tinggi (termofilik) dengan jalan membentuk spora. Cara hidup yang demikian memungkinkan bakteri ini dapat hidup pada makanan kaleng, terutama pada jenis-jenis makanan yang bahan bakunya daging, ikan, sayur yang pHnya di atas 4,6 alias nilai keasaman relatif rendah. Bila kondisi pertumbuhannya sesuai, toksin botulinum yang sangat berbahaya itu bisa dihasilkan. Jika dikonsumsi maka racun tersebut akan menyerang susunan saraf dan dampaknya bisa melumpuhkan, menyulitkan pernapasan serta menyebabkan kematian.

1.      Indikator Kebusukan

            Masa simpan atau daya awet dari produk daging dan unggas dapat diketahui dari kandungan mikroorganisme pembusuk di dalamnya. Kebusukan yang umum terjadi dipengaruhi oleh jenis produk, komposisi produk, proses termal yang diterapkan terhadap produk, kontaminasi selama pengolahan dan pengepakan, cara pengepakan, dan suhu, serta waktu penyimpanan.  

            Mikroorganisme yang menjadi indicator kebusukan pada produk pangan daging merah dan unggas ini bervariasi tergantung dari jenis produknya. Untuk daging segar yang belum diolah, dimana kebusukan biasanya disebabkan oleh bakteri gram negative berbentuk batang seperti  Pseudomonad, biasanya ditetapkan pada suhu 20°C hitungan cawan selama tiga hari menggunakan Plate Count Agar (PCA). Sedangkan produk daging yang di kemas di dalam plastic yang tidak tembus oksigen, misalnya pada sosis yang dikemas/dibungkus secara vakum di dalam plastic, kebusukan disebabkan oleh bakteri asam laktat. Dalam keadaan ini, inkubasi masih dapat dilakukan pada suhu 20°C selama tiga hari, PCA dapat diganti dengan agar APT untuk memperbesar ukuran koloni. Jika digunakan medium PCA, bakteri asam laktat akan membentuk koloni berukuran kecil.

            Jumlah bakteri asam laktat di dalam produk daging olah yang di kemas secara vakum mempengaruhi kecepatan pembusukan suatu produk pangan yang ditandai dengan terjadinya perubahan citarasa menjadi asam dan perubahan warna cairan daging yang keluar menjadi keputih-putihan. Jumlah hitungan cawan aerobic pada produk-produk pangan yang baru diolah menunjukkan jumlah bakteri yang tahan terhadap proses pengolahan dan tingkat kontaminasi peralatan dan sumber lainnya. Namun daya simpan dari produk daging yang dikemas tidak dapat diketahui dari jumlah hitungan cawan aerobiknya, karena sebagian besar bakteri yang terhitung dalam pengujian total koloni bakteri aerobic tidak dapat utmbuh selama penyimpanan dengan kondisi vakum tersebut.

2.6 Persiapan Uji mikroorganisme

2.6.1 Sterilisasi

            Bahan atau peralatan yang digunakan dalam bidang mikrobiologi harus dalam keadaan steril. Steril artinya tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya, baik yang mengganggu atau merusak media atau mengganggu kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan. Setiap proses baik fisika, kimia dan mekanik yang membunuh semua bentuk hidup terutama mikroorganisme disebut sterilisasi.

            Ada beberapa metode sterilisasi, yaitu:

a. Sterilisasi secara fisik

            Cara membunuh mikroba ini dengan memakai panas (Thermal kill). Panas tersebut akan mendenaturasi protein, terutama enzim-enzim dan membran sel. Panas kering membunuh bakteri karena oksidasi komponen-komponen sel. Daya bunuh panas kering tidak sebaik panas basah. Hal ini dibuktikan dengan memasukkan biakan mikroba dalam air mendidih akan cepat mati daripada dipanasi secara kering.

1). Pemanasan Basah

- Otoklaf

            Alat ini serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap air. Dalam otoklaf, yang mensterilkannya adalah panas basah, bukan tekanannya. Oleh karena itu setelah air di dalam tangki mendidih dan mulai terbentuk uap air, maka uap air ini akan mengalir ke ruang pensteril guna mendesak keluar semua udara di dalmnya.

- Tyndallisasi

            Metode ini berupa mendidihkan medium dengan uap beberapa menit saja. Setelah didiamkan satu hari, selama itu spora-spora sempat tumbuh menjadi bakteri vegetatif, maka medium tersebut dididihkan lagi selama beberapa menit. Akhirnya pada hari ketiga, medium tersebut dididihkan sekali lagi. Dengan jalan demikian diperoleh medium steril, dan zat-zat organik yang terkandung di dalamnya tidak mengalami perubahan.

- Pasteurisasi

            Pasteurisasi adalah suatu cara disinfeksi dengan pemanasan yang pertamakalinya dilakukan oleh Pasteur dengan maksud untuk mengurangi jumlah mikroorganisme pembusuk (perusak) di dalam anggur tanpa merusak anggur tersebut. Suhu yang dipergunakan pada pasteurisasi adalah sekitar 69^oC, dan waktu yang digunakan adalah 30 menit.

2). Pemanasan Kering

- Oven

            Sterilisasi ini menggunakan udara panas. Alat-alat yang disterilkan ditempatkan dalam oven di mana suhunya dapat mencapai 160-180^oC. Caranya adalah dengan memanaskan udara dalam oven tersebut dengan gas atau listrik. Oleh karena daya penetrasi panas kering tidak sebaik panas basah, maka waktu yang diperlukan pada sterilisasi cara ini lebih lama yakni selama 1 – 2 jam. Sterilisasi cara ini baik dipergunakan untuk mensterilkan alat-alat gelas seperti cawan petri, pipet, tabung reaksi, labu dan sebagainya.

- Pembakaran (incineration)

            pembakaran merupakan cara sterilisasi yang 100% efektif, tetapi ini terbatas penggunaannya. Cara ini biasa dipergunakan untuk mensterilkan alat penanam kuman (jarum ose/sengkelit), yakni dengan membakarnya sampai pijar. Dengan cara ini semua bentuk hidup akan dimatikan. Pembakaran juga dilakukan untuk bangkai binatang percobaan yang mati.

3). Penyinaran dengan sinar gelombang pendek

            Mikroorganisme di udara dapat dibunuh dengan penyinaran memakai sinar ultraviolet. Panjang gelombang yang dapat membunuh mikroorganisme adalah 220 – 290 nm. Radiasi yang paling efektif adalah 253,7 nm. Untuk memperoleh hasil yang baik, maka bahan-bahan yang disterilkan, baik yang berupa cairan, gas atau aerosol harus dilewatkan (dialirkan) atau ditempatkan langsung di bawah sinar ultra ungu dalam lapisan-lapisan yang tipis.

b. Sterilisasi secara Kimia

            Antiseptik kimia biasanya dipergunakan dan dibiarkan menguap seperti halnya alkohor. Umumnya isopropil alkohol 70-90% adalah yang termurah namun merupakan antiseptik yang sangat efisien dan efektif. Penambahan yodium pada alkohol akan meningkatkan daya disinfeksinya. Dengan atau tanpa yodium, isopropil tidak efektif terhadap spora. Solusi terbaik untuk membunuh spora adalah campuran formaldehid dengan alkohol, tetapi solusi ini terlalu toksik untuk dipakai sebagai antiseptik. Zat-zat kimia yang dapat dipakai untuk sterilisasi antara lain adalah halogen (senyawa klorin, yodium), alkohol, fenol, hidrogen peroksida, zat warna ungu kristal, derivat akridin, rosanalin, deterjen, logam-logam berat (Hg, Ag, As, aldehida, gas ETO (oksida etilen), uap formaldehid, beta-propilakton.

c. Sterilisasi secara mekanik

            Beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan atau penguraian, maka sterilisasi yang dilakukan adalah dengan cara mekanik, misalnya dengan saringan. Dalam mikrobiologi, penyaringan secara fisik yang paling banyak digunakan adalah dengan penggunaan filter khusus, misalnya filter berkefeld, filter Chamberland dan filter Seitz. Jenis filter yang dipakai atau yang akan dipergunakan tergantung pada tujuan penyaringan dan benda yang akan disaring.

- Menyaring cairan

            Hal ini dapat dilakukan dengan berbagai filter seperti saringan seitz yang menggunakan saringan asbestos sebagai alat penyaringnya, saringan Berkefeld yang menggunakan filter yang terbuat dari tanah diatom, saringan Chamberland yang menggunakan filter yang terbuat dari porselen, dan fritted glass filter, yang menggunakan filter yang terbuat dari serbuk gelas.

- Menyaring udara

            Untuk menjaga suatu alat yang sudah steril agar tidak tercemar oleh mikroba atau untuk menjaga agar suatu biakan kuman tidak tercemar olah kuman yang lain, maka alat-alat tersebut harus ditutup dengan kapas,

karena kapas mudah ditembus udara tetapi dapat menahan mikroorganisme. Harus dijaga agar kapas tidak menjadi basah, oleh karena kapas yang basah memungkinkan kuman menembus ke dalam. Untuk mencegah pencemaran oleh kuman-kuman udara pada waktu menuang perbenihan, dapat digunakan suatu alat yang disebut Laminar flow di mana udara yang masuk ke dalamnya disaring lebih dahulu dengan suatu saringan khusus. Saringan ini ada batas waktu pemakaiannya.

2.6.2 Mikroskop dan Pemeriksaan Mikroskopi

            Mikroskop adalah intrumen yang paling banyak digunakan dan paling bermanfaat di laboratorium mikroskopi. Dengan alat ini diperoleh perbesaran sehingga memungkinkan untuk melihat organisme dan struktur yang tak tampak dengan mata bugil. Mikroskop memungkinkan perbesaran dalam kisaran luas dari seratus kali sampai ratusan ribu kali.

            Mikroskop yang ada terdiri dari dua kategori yaitu mikroskop cahaya (optis) dan mikroskop elektron. Keduanya berbeda dalam prinsip yang mendasari perbesaran.

Mikroskop cahaya yang kesemuanya menggunakan sistem lensa optis, mencakup mikroskop:

-          medan terang

-          medan gelap

-          fluoresensi

-          kontras fase.

Mikroskop elektron menggunakan berkas elektron sebagai pengganti gelombang cahaya untuk memperoleh bayangan yang diperbesar.

A. Mikroskop cahaya

1). Mikroskop medan terang

            Dalam mikroskop medan terang, medan mikroskop atau daerah yang diamati diterangi dengan benderang sehingga objek-objek yang sedang ditelaah tampak lebih gelap dari pada latar belakangnya. Pada umumnya mikroskop semacam ini menghasilkan pembesaran berguna maksimum sekitar 1.000 diameter. Dengan sedikit modifikasi termasuk lensa mata (okuler) yang berkekuatan tinggi, pembesaran ini dapat ditingkatkan. Aakan tetapi pembesaran 1.000 sampai 2.000 diameter merupakan batas pembesaran bermanfaat yang dapat diperoleh dengan peralatan seperti itu. Mikroskop majemuk, pembesaran dicapai dengan menggunakan sistem lensa berlawanan dengan mikroskop sederhana Leeuwenhoek, yang hanya mengguanakan lensa tunggal, dimana lensa terdapat pada kondensor memusatkan kerucut cahaya pada medan spesimen. Sebagian dari berkas cahaya dalam kerucut cahaya ini secara langsung menembus lensa objektif untuk membentuk cahaya latar belakang atau medan terang. Berkas cahaya yang mengenai objek (mikroorganisme) pada spesimen tersebut dan menjadi “bengkok” difokuskan oleh lensa objektif sehingga terbentuk bayangan objek tadi. Bayangan tersebut diperbesar oleh lensa okuler. Jadi yang memberikan pembesaran permulaan ialah sistem lensa objektif kemuduan lebih diperbesar lagi oleh sistem lensa okuler.

            Mikroskop yang umum digunakan dalam mikrobiologi biasanya dilengkapi dengan tiga objektif, masing-masing memberikan derajat pembesaran yang berlainan, yang terpancang pada turret yaitu suatu alas (platform) yang dapat diputar untuk menggerakkan masing-masing objektif sehingga letaknya segaris dengan kondensor. Pembesaran total yang dapat dicapai dengan salah satu objektif manapun ditentukan dengan mengalikan daya pembesaran lensa objektif dengan daya pembesaran lensa mata, yang biasanya 10 kali (x 10).

            Pembesaran yang berguna terbatas oleh dayapisah suatu mikroskop, yaitu kemampuan untuk menghasilkan bayangan berlainan dari dua titik yang berdekatan (titik disini berarti objek atau bagian kecil-kecil objek). Dayapisah suatu mikroskop cahaya ditentukan oleh panjang gelombang cahaya dan sifat lensa objektif dan lensa kondensor yang dikenal dengan tingkap numeris (numerical aperture atau NA).

2). Mikroskop medan gelap

            Mikroskop medan gelap diperoleh dari macam mikroskop yang sama seperti yang digunakan untuk mikroskop medan terang kecuali bahwa alat itu diperlengkapi dengan kondensor medan gelap dan suatu objektif ber NA rendah. Macam kondensor ini mengarahkan berkas cahaya ke dalam medan spesimen pada sudut yang sedemikian hingga hanyalah berkas-berkas yang mengenai objek pada medan spesimen itu dibiaskan dan memasuki objektif, maka objek itu menjadi terang-benderang dan sangat nyata terhadap medan gelap (latar belakang yang gelap). Mikroskop medan gelap terutama berguna untuk pemeriksaan mikroorganisme hidup. Teknik ini sangat berguna bagi identifikasi bakteri yang menyebabkan sifilis.

            Mikroskop fluoresensi (pendar fluor) telah menjadi prosedur yang penting dan dipakai secara amat luas untuk laboratorium rumah sakit dan klinis. Digunakan untuk memeriksa spesimen yang telah diwarnai dengan zat-zat pewarna fluorokrom sehingga memungkinkan identifikasi mikroorganisme dengan cepat. Zat-zat pewarna ini menterap energi gelombang cahaya pendek tak kasatmata sambil memancarkan gelombang-gelombang panjang, gelombang kasatmata yang lebih besar. Bahan seperti itu dinamakan fluoresen dan fenomena ini dinamakan fluoresensi (pendar fluor). Asas ini digabungkan dengan teknik-teknik yang memungkinkan untuk mengidentifikasi mikroorganisme secara khusus dengan pemeriksaan mikroskopis secara langsung. Cara-cara kerja laboratorisnya dapat dilaksanakan dengan cepat.

4). Mikroskopi kontras fase

            Mikroskop kontras fase adalah suatu tipe mikroskopi cahaya yang memungkinkan kontras yang lebih besar antara substansi dengan berbagai ketebalan atau berbagai indeks bias. Hal tersebut dapat dicapai dengan menggunakan kondensor dan objektif yang khusus yang mengendalikan iluminasi objeknya dengan jalan mengaksentuasikan perbedaan-perbedaan yang kecil dalam ketebalan atau indeks bias struktur-struktur seluler. Perbedaan-perbedaan itu tersingkapkan dalam derjat terang atau derajat gelap yang berlainan (kontras yang lebih nyata). Dengan teknik ini dapat ditemukan letak struktur-struktur di dalam sel yang tidak diwarnani yang tak teramati dengan mikroskop medan terang.

B. Mikroskop elektron

            Mikroskop elektron memberikan pembesaran berguna yang jauh lebih besar dari pada yang mungkin beroleh dengan mikroskopi cahaya. Hal ini dimungkinkan oleh dayapisah yang lebih besar yang diperoleh karena berkas-berkas elektron yang digunakan untuk pembesaran mempunyai panjang gelombang yang sangat pendek dibandingkan dengan cahaya. Berkas elektron yang dipakai dalam mikroskopi elektron mempunyai panjang gelombang yang berkisar antara 0,005 sampai 0,0003 µm. Panjang gelombang yang teramat pendek tersebut dari sinar elektron ini memungkinkan dicapainya dayapisah beberapa ratus kali lebih besar dari pada yang dapat diperoleh dengan mikroskopi cahaya. Dengan menggunakan mikroskopi elektron ini memungkinkan untuk memisah-misah objek dalam kisaran 0,0003 µm.

            Untuk mikroskopi elektron, spesimen yang harus diperksa disiapkan sebagai suatu lapisan kering yang teramat tipis pada layar kecil dan dimasukkan k edalam alat itu pada titik diantara kondensor magnetik dan objektif magnetik (sistem optis kaca tidak digunakan pada mikroskopi elektron), yang sebanding dengan kondensor dan objektif pada mikroskop cahaya. Bayangan yang diperbesar tampak pada layar fluoresen atau terekam pada film fotografik oleh kamera yang terpasang pada instrumen tersebut.

            Banyak teknik dikembangkan untuk pemeriksaan mikroorganisme dengan mikroskopi elektron. Diantaranya adalah metode-metode pewarnaan yang baru, yaitu metode untuk mengiris sel-sel mikrobe menjadi irisan-irisan tipis mikroskopis untuk pemeriksaan dan teknik radioaktif. Semua prosedur ini diterapkan untuk mikroskopi elektron transmisi (MET). Dalam mikroskopi ini, berkas elektron melewati spesimen dan hamburan elektron ini menghasilkan bayangan. Mikroskopi elektron ini telah mengalami perkembangan suatu modifikasi (ubahsuai) yang dikenal dengan mikroskopi elektron payar (MEP). Dengan prosedur ini spesimen dikenai berkas elektron sedemikian rupa sehingga memungkinkan untuk memperoleh pandangan permukaan tiga dimensi sel-sel.

Komposisi Media

            Pada hakekatnya komposisi media yang baik adalah sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme untuk melakukan metabolisme seperti pada habitat aslinya (kondisi alamiah).

            Dewasa ini untuk keperluan penelitian maupun pekerjaan di laboratorium banyak dipermudah dengan adanya bermacam-macam media yang tersedia dalam bentuk serbuk kering.

            Di bawah ini ada beberapa media yang menggunakan bahan serbuk kering:

1). Nutrient Agar (NA)

Komposisi I :

- Ekstrak daging (beef)                       3 gram

- Pepton                                               5 gram

- Bacto Agar                                       15 gram

- Air suling                                          1000 ml

Komposisi II :

- Daging segar                                     500 gram

- Pepton                                               10 gram

- Bacto Agar                                       15 gram

- Air suling                                          1000 ml

Komposisi III:

- Ekstrak daging                                  3 gram

- Pepton                                               5 gram

- NaCl                                                 5 gram

- Agar                                                  1,5 – 2%

- Akuades                                            1000 ml

pH       7,3

2.6.3 Penanaman dan Isolasi Mikroorganisme

            Semua alat, bahan dan medium yang digunakan untuk inokulasi (penanaman) harus-harus benar-benar steril, hal ini untuk menghindari kontaminasi, yakni masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan. Langkah-langkah pada pekerjaan inokulasi dan isolasi mikroba adalah sebagai berikut:

1). Menyiapkan ruangan

            Ruang tempat inokulasi harus bersih dan bebas angin. Dinding ruang yang basah menyebabkan butir-butir debu menempel. Pada waktu mengadakan inokulasi, baik sekali bila meja tempat inokulasi didasari dengan kain basah. Inokulasi dapat dilakukan di dalam suatu kotak kaca (ent-kas).

2). Pemindahan dengan kawat inokulasi

            Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau nikrom, ujung kawat boleh lurus, boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1-3 mm. Lebih dahulu ujung kawat ini dipijarkan, sedang sisanya sampai tangkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin kembali, ujung kawat itu disentuhkan suatu koloni. Mulut tabung tempat pemeliharaan itu dipanasi juga setelah sumbatnya diambil. Setelah pengambilan inokulum (sampel bakteri) selesai, mulut tabung dipanasi lagi kemudian disumbat seperti semula. Ujung kawat yang yang membawakan inokulum tersebut digesekkan pada medium baru atau pada suatu kaca benda, kalau tujuannya memang akan membuat suatu sediaan.

3). Pemindahan dengan pipet

            Cara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air minum atau penyelidikan susu. Untuk itu diambil 1 ml contoh (sampel) untuk diencerkan dengan 99 ml air murni yang telah disterilkan. Dalam pengenceran ini tergantung dari keadaan air atau susu yang diselidiki. Kemudian diambil 1 ml dari hasil pengenceran ini untuk diambil dengan pipet dan dituang ke cawan petri yang berisi medium agar-agar yang masih dalam keadaan cair dan dicampuraduk sampai homogen. Setelah agar-agar membeku, cawan tersebut disimpan di di dalam inkubator. Peliharaan yang diperoleh dengan cara di atas terkenal dengan nama peliharaan adukan. Dengan cara ini bakteri yang diinokulasikan tadi dapat menyebar luas ke seluruh medium. Bakteri aerob dan anaerob dapat tumbuh di situ, dan banyaknya koloni dapat dihitung dengan mudah.

4). Teknik Biakan Murni (Cara Menyendirikan Piaraan Murni)

            Di alam bebas tidak ada mikroba yang hidup tersendiri terlepas dari spesies yang lain. Seringkali mikroba patogen kedapatan secara bersama-sama dengan mikroba saproba (saprobakteri). Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah kontaminasi dari laur. Medium untuk membiakkan mikroba haruslah steril sebelum digunakan. Kontaminasi dari luar terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Teknik biakan murni untuk suatu spesies dapat dilakukan dengan beberapa cara.

a. Cara Pengenceran

            Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Lister berhasil memelihara murni Streptococcus lactis yang diisolasi dari susu yang sudah asam. Caranya adalah dengan mengencerkan suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari pengenceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi. Kalau perlu dari hasil pengenceran kedua diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Gari hasil pengenceran ketiga diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar akan ditemukan beberapa koloni yang tumbuh pada medium tersebut, tapi mungkin juga yang ditemukan hanya 1 koloni murni dan selanjutnya spesies ini dapat dijadikan piaraan murni (biakan murni). Kalau belum yakin, bahwa koloni tunggal yang diperoleh tersebut murni, maka dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni tersebut sebagai sampel.

b. Cara penuangan

            Metode ini pertama kali dilakukan oleh Robert Koch (1843-1905). Caranya adalah dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel itu kemuadian disebarkan dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Setelah medium engental, maka beberapa jam kemudian nampaklah koloni yang masing-masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan seperti di atas, akhirnya akan diperoleh biakan murni yang lebih terjamin. Dalam penemuan metode penuangan ini ada dua orang pembantu Koch yang sangat berjasa, yaitu Petri yang menciptakan cawan dengan tutup, yang sekarang dikenal dengan cawan petri (petri dish). Ornag yang kedua adalah Hesse yang menemukan agar-agar untuk mengantikan gelatin.

c. Cara Penggesekan/Pengoresan

            Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan cara ini adalah bakteri-bakteri anaerob tidak dapat tumbuh. Untuk mendapatkan koloni yang terpisah sewaktu melakukan goresan harus memperhatikan, antara lain:

-          Gunakan ose (sengkelit) yang dingin untuk menggores permukaan lempengan agar. Sengkelit yang panas akan mematikan mikroorganisme, sehingga tidak terjadi pertumbuhan pada bekas goresan.

-          Sewaktu menggores, sengkelit dibiarkan meluncur di atas permukaan lempengan. Agar yang luka akan mengganggu pertumbuhan mikroorganisme, sehingga sulit diperoleh koloni yang terpisah.

-          Sengkelit harus dipijarkan setelah menggores suatu daerah, hal ini bertujuan untuk mematikan mikroorganisme yang melekat pada mata ose dan mencegah pencemaran pada penggoresan berikutnya.

-          Menggunakan tutup cawan petri untuk melindungi permukaan supaya terhindar dari pencemaran.

-          Membalikkan lempengan agar untuk mencegah air kondensasi jatuh di atas permukaan sehingga dapat terjadi penyebaran koloni.

Ada beberapa teknik penggesekan, yaitu:

a.       Goresan T

-          Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan petri.

-          Inokulasikan daerah 1 sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung.

-          Panaskan ose dan biarkan dingin kembali.

-          Gores ulang daerah 1 sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan ke daerah 2.

-          Pijarkan kembali ose dan dinginkan kembali.

-          Prosedur di atas diulangi untuk daerah 3.

b.      Goresan Kuadran, teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4.

c.       Goresan Radian

-          Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan.

-          Pijarkan sengkelit dan dinginkan kembali.

-          Putar lempengan agar 90^o dan buat goresan terputus di atas goresan sebelumnya.

-          Pijarkan ose.

d.      Goresan sinambung

-          Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar.

-          Jangan pijarkan ose, putar lempengan 180^o, gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar.

2.6.4 Uji Koloni Mikroba

Metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah koloni mikroba di dalam bahan pangan terdiri dari metoda hitungan cawan, Most Propable Number (MPN) dan metode mikroskopik langsung. Dari ketigas metode tersebut metode hitungan cawan paling banyak digunakan.

Metode Hitungan Cawan

Metode hitungan cawan merupakan metode yang paling sensitif untuk menentukan jasad renik, dengan prinsip jika sel jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar maka sel jasad renik tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung tanpa menggunakan mikroskop (Fardiaz, 1992).  Keuntungan menggunakan metode hitungan cawan dalam menghitung jumlah koloni pada medium agar adalah sebagai berikut:

1.      Hanya sel yang masih hidup yang dihitung

2.      beberapa jenis jasad renik dapat dihitung secara langsung

3.      dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi jasad renik karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu jasad renik yang mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik.

Selain keuntungan yang dimiliki seperti tersebut di atas, metode hitungan cawan juga memiliki kelemahan seperti yang termuat dalam Fardiaz (1992), yaitu:

1.      Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni

2.      medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbed

3.      jasad renik yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang nampak dan jelas, tidak menyebar.

4.      memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung.

Metode hitungan cawan dapat dibedakan dalam dua cara yaitu metode tuang (pour plate) dan metode permukaan (surface plate) (Fardiaz, 1993).

1.         Metode Tuang (Pour Plate)

Dari pengenceran yang dikehendaki, sebanyak 1 ml atau 0,1 ml larutan tersebut dipipet ke dalam cawan petri menggunakan pipet 1 ml atau 1,1 ml. Sebaiknya waktu antara dimulainya pengenceran sampai menuangkan ke dalam cawan petri tidak boleh lebih lama dari 30 menit. Kemudian ke dalam cawan tersebut dimasukkan agar cair steril yang telah didinginkan sampai 47-50⁰C sebanyak 15-20 ml. Selama penuangan medium, tutup cawan jangan dibiarkan dibuka terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi dari luar. Segera setelah penuangan cawan petri digerakkan di atas meja secara hati-hati, untuk menyebarkan sel-sel secara merata, yaitu dengan gerakkan melingkar atau gerakan seperti angka delapan. Setelah agar memadat, cawan-cawan tersebut dapat diinkubasikan di dalam incubator dalam posisi terbalik (Fardiaz, 1993).

2.   Metoda Permukaan (Surface/Spread Plate)

Pada pemupukan dengan metode permukaan, agar steril terlebih dahulu dituangkan ke dalam cawan petri dan biarkan membeku. Setelah membeku dengan sempurna, kemudian sebanyak 0,1 ml contoh yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut. Sebuah batang gelas melengkung (hockey stick) dicelupkan ke dalam alcohol 95% dan dipijarkan sehingga alcohol habis terbakar. Setelah dingin batang gelas tersebut digunakan untuk digunakan untuk meratakan contoh di atas medium agar dengan cara memutarkan cawan petri di atas meja. Selanjutnya inkubasi dan perhitungan koloni dilakukan seperti pada metode penuangan. Tetapi harus diingat bahwa  jumlah contoh yang ditumbuhkan adalah 0,1 ml, jadi harus dimasukkan dalam perhitungan “total count” (Fardiaz, 1993).

2.6.5 Cara Penghitungan Koloni Bakteri

Perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan secara decimal. Sebagai contoh misalnya penetapan jumlah koloni pada susu. Pengenceran awal 1:10 = 10^-1 dibuat dengan cara mengencerkan 1 ml susu ke dalam 9 ml larutan pengencer, dan dilanjutkan dengan pengenceran yang lebih tinggi misalnya sampai 10^-5 atau 10^-6, tergantung pada mutu susunya. Semakin tinggi jumlah mikroba yang terdapat di dalam susu, semakin tinggi pengenceran yang harus dilakukan. Jika setelah inkubasi misalnya diperoleh 62 koloni cawan yang mengandung pengenceran 10^-4, maka jumlah koloni dapat dihitung sebagai berikut (1 ml larutan pengenceran dianggap mempunyai berat 1 gr) :

Faktor pengenceran =

= pengenceran awal x pengenceran selanjutnya x jumlah yang ditumbuhkan  

=

Koloni per ml =

Perhitungan jumlah koloni mikroba per cm² permukaan =

            Kerusakan bahan oleh mikroba disebabkan oleh adanya pemecahan komponen makanan oleh  Mikroba seperti karbohidrat, protein, lemak dan H2O2 dan lain-lain.

Karbohidrat

            Kebanyakan microbe dapat menggunakan karbohidrat sebagai sumber energy. Masing-masing mikroba berbeda dalam kemampuannya untuk menggunakan berbagai kerbohidrat, dan dalam caranya memecah karbohidrat. Tergantung dari spesiesnya, hasil-hasil akhir dari pemecahan karbohidrat oleh mikroba dapat berupa asam-asam organic (asam laktat, asetat, butirat atau propionate), produk-produk netral (aseton, butyl alcohol, etil alkohol), dan bermacam-macam gas (metana, hydrogen, karbondioksida). Terbentuknya hasil-hasil akhir dari pemecahan karbohidrat tersebut dapat dilihat melalui beberapa pereaksi.

2.7  Teknik-teknik pewarnaan

Mikroorganisme sangat sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak membiaskan cahaya. Dengan alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga mikroorganisme tersebut terlihat kontras dengan sekelilingnya.

Banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis. Telah dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan untuk :

a.             Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar.

b.            Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.

c.             Membantu mengidentifikasi dan/atau membedakan organisme yang serupa.

Langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikrobe yang diwarnai untuk pemeriksaan mikroskopik ialah :

a.             Penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen pada kaca objek.

b.            Fiksasi olesan itu pada kaca objek, biasanya dengan pemanasan, menyebabkan mikroorganisme itu melekat pada kaca objek.

c.             Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial).

Pewarnaan sederhana, pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis atau olesan yang sudah difiksasi dinamakan pewarnaan sederhana. Lapisan tadi digenangi dengan larutan pewarna selama jangka waktu tertentu, kemudian larutan itu dicuci dengan air dan kaca objeknya dikeringkan dengan kertas pengisap. 

            Pewarnaan diferensial, prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikrobe disebut teknik pewarnaan diferensial. Dengan teknik ini biasanya digunakan lebih dari satu larutan zat pewarna atau reagen pewarnaan.

            Pewarnaan gram, adalah salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri ialah dengan pewarnaan gram. Dalam proses ini olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut dalam urutan yang telah ditentukan, yaitu ungu kristal, larutan yodium, alkohol (bahan pemucat) dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua kelompok. Salah satu diantaranya adalah bakteri gram positif, mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain adalah bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak berwarna merah.

            Pewarnaan gram masih merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Terutama lebih banyak digunakan di laboratorium diagnostik rumah sakit karena informasi yang diperoleh dari pengamatan spesimen yang diwarnani dengan pewarna gram dilakukan dengan cepat dan dapat memberi pentujuk akan organisme penyebab suatu infeksi.

            Beberapa macam metode pewarnaan, yaitu:

1). Pewarnaan spora

            Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan panas dan tahan bahan kimia. Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang tidak menguntungkan bagi bakteri tersebut. Bakteri pembentuk spora antara lain Bacillus, Clostridium, Thermoactinomyces, Sporosarcina dan lain lain.

            Spora bakteri dapat diwarnai dengan cara dipanaskan. Pemanasan ini menyebabkan lapisan luar spora mengembang sehingga zat warna dapat masuk. Bahan yang digunakan untuk pewarnaan spora adalah larutan hijau malakhit dan larutan safranin.

2). Pewarnaan kapsula

            Lapisan kapsul cukup tebal, sehingga dapat dilihat dengan mikroskop cahaya, namun demikian sulit diwarnai sehingga perlu diberi pewarnaan khusus. Pada pewarnaan negatif, latar belakangnya diwarnai zat warna negatif, sedangkan bakterinya diwarnai zat warna basa. Kapsula tidak menyerap warna sehingga terlihat lapisan terang tembus dengan latar belakang yang berwarna. Salah satu pewarnaan kapsula menurut raebiger yaitu dengan menggunakan laruta formol-gentian violet Raebiger.

3). Pewarnaan flagela

            Untuk melihat flagela digunakan cara khusus. Penambahan bahan kimia berupa larutan mordan yang berguna untuk membengkakkan flagela sehingga dapat dilihat dengan mikroskop cahaya.

4). Pewarnaan badan inkluisi

            Beberapa bakteri dapat mensintesis badan inklusi atau granula yang disimpan dalam sitoplasma. Asam PHB membentuk granula seperti lipida dapat diwarnai dengan zat warna yang larut dalam lipida, sperti Sudan black B. Zat warna ini mewarnai granula PHB menjadi biru tua, sedangkan sitoplasma menjadi merah. Bila ada spora dalam bakteri, maka spora ini tidak akan menyerap warna. Zat warna yang larut dalam lipida seringkali disebut zat warna netral, karena bagian berwarnanya tidak mempunyai muatan dan mewarnai granula lipida karena larut dalam bahan lipida.

2.8  Ketahanan Mikroba Terhadap Perlakuan Panas

Dalam pengolahan dengan suhu tinggi ada 2 faktor yang harus diperhatikan yaitu jumlah panas yang diberikan harus cukup untuk mematikan mikroba pembusuk dan patogen dan jumlah panas yang digunakan tidak boleh menyebabkan penurunan gizi dan cita rasa makanan. Dalam proses pemanasan ada hubungan antara panas dan waktu, yaitu jika suhu yang digunakan rendah maka waktu pemanasan lama begitu juga sebaliknya. (Winarno, 1980)

Pengolahan dengan suhu tinggi dapat dilakukan dengan berbagai cara diantaranya adalah sterilisasi, pasteurisasi, dan blanching. (Kartasapoetra, 1989). Sterilisasi adalah membebaskan bahan dari semua mikroba dikarenakan  beberapa spora bakteri relatif lebih tahan terhadap panas. Selama proses sterilisasi dapat terjadi beberapa perubahan terhadap makanan yang dapat menurunkan mutunya. Oleh karena itu jumlah panas yang diberikan harus dihitung sedemikian rupa sehingga tidak merusak mutu makanan.(Winarno, 1980)

Sterilisasi  yaitu penggunaan suhu panas untuk membunuh mikroba dengan suhu tinggi (121˚C selama 15 menit). Sterilisasi yang dapat dilakukan pada bahan pangan adalah sterilisasi komersial. Makanan yang disteril secara komersil berarti semua mikroba penyebab penyakit dan pembentuk racun dalam makanan telah dimatikan, demikian juga mikroba pembusuk (Winarno, 1982). Pemanasan dengan cara ini dapat dilakukan dengan menggunakan uap air panas bertekanan tinggi dan dapat dilakukan di dalam alat “sterilizer”, “autoclave”, atau “retort”. Uap air pada 5 psi (di atas tekanan udara 1 atm) bersuhu 109˚C, pada 10 psi bersuhu 115,5˚C dan pada 15 psi bersuhu 121,5˚C (Winarno, 1982).

Dengan indera, kita dapat mendeteksi adanya perubahan-perubahan didalam makanan kita, tidak terkecuali kerusakan terhadap protein. Salah satu pengolahan dengan suhu tinggi adalah pemanasan (blanching). Telah terbukti pemanasan yang berlebihan sangat merugikan nilai gizi protein. Pada umumnya protein yang dipanaskan pada suhu yang tinggi akan lebih sulit untuk dicerna. Nilai pemanasan dalam usaha pembebasan dari pasasit-parasit dan penyakit-penyakit yang disebabkan oleh bakteri adalah sangat penting. Kita mengetahi bahwa perlakuan-perlakuan terhadap makanan harus diperlunak atau diperkecil ukuran teksturnya, bila kita megkehendaki untuk memperlambat secara optimal sebagai sumber zat dan gizi (Desroiser, 1988)

Pasteurisasi merupakan perlakuan panas pada suhu yang lebih rendah daripada sterilisasi, dan biasanya dilakukan pada suhu dibawah titik didih air. Pasteurisasi biasanya disertai dengan cara pengawetan yang lain, misalnya makanan yang dipasteurisasi kemudian disimpan dengan cara pendinginan. Bahan pangan yang dipasteurisasi seperti susu dapat disimpan selama 1 minggu didalam lemari es atau lebih tanpamengalami perubahan rasa yang nyata. Pasteurisasi biasanya dilakukan pada suhu 63 ^oC (145 ^oF) selama 30 menit. Kadang-kadang pasteurisasi juga dilakukan secara cepat yaitu 72 ^oC (161 ^oF) selama 15 detik. (Winarno, 1980)

Blanching adalah pemanasan pendahuluan yang biasanya dilakukan terhadap buah-buahan dan sayur-sayuran terutama untuk menginaktifkan enzim-enzim dalam di bahan pangan tersebut, diantaranya adalah enzim katalase dan peroksidase yang merupakan enzim-enzim yang paling tahan panas pada sayur-sayuran ( Winarno, 1980). Perlakuan blanching  praktis selalu dilakukan jika bahan pangan akan dibekukan, karena pembekuan tidak dapat menghambat keaktifan enzim dengan sempurna. Tergantung panas yang diberikan, “blanching” juga dapat mematikan beberapa mikroba   ( Winarno, 1980).

Meskipun bukan untuk tujuan pengawetan, tetapi blanching merupakan penggunaan panas yang selalu dilakukan sebelum bahan pangan tersebut dikalengkan, dikeringkan atau dibekukan Tergantung pada proses selanjutnya, blanching dapat dibedakan dalam dua perlakuan yaitu:

a.Blanching sebagai perlakuan pendahuluan untuk proses pembekuan dan pengeringan

b.Blanching sebagai perlakuan pendahuluan untuk proses pengalengan (Winarno, 1980).

Menurut winarno (1980) tujuan blanching sebagai perlakuan pendahuluan pada proses pembekuan dan pengeringan adalah :

1.      Untuk mengurangi jumlah mikroba pada permukaan bahan pangan dengan cara menurunkan mikroflora dari produk selama proses

2.      Untuk menginaktifkan enzim yang tidak diinginkan yang mungkin dapat merubah warna, tekstur, cita rasa, maupun nutrisinya dalam penyipanan

3.      Membersihkan atau menghilangkan beberapa substansi semacam getah pada bahan dasar yang dapat menyebabkan off flavour

4.      Mempertahankan warna alami bahan pangan

Perambatan panas dapat berjalan secara konduksi, konversi dan radiasi. Dalam pengalengan makanan biasanya perambatan panas berjalan secara konveksi dan konduksi. Sifat perambatan panas ini perlu diperhatikan untuk menentukan jumlah panas optimum yang harus diberikan pada makanan kaleng. (Desrosier, 1988)

Pengolahan dengan suhu tinggi dapat juga dilakukan dengan metoda pengeringan dengan cara mengeluarkan air seluruhnya atau sebagian dari suatu bahan dengan cara menguapkannya dengan menggunakan energi panas. Biasanya kandungan air bahan tersebut dikurangi sampai suatu batas agar mikroba tidak dapat tumbuh didalamnya. (Kartasapoetra, 1989)

III.             MATERI METODA

3.1  Bahan dan Peralatan Praktikum

Bahan yangdugunakan dalam praktikum ini adalag sayur, susu dan telur. Bahan kimia yang digunakan antara lain media PCA (Plat Count Agar), garam Fisiologis, Kristal violet, iodium, alkohol, safranin, aquades.

            Peralatan yang digunakan timbangan analitik, onkubator, pipet 1 ml, jarum ose, kaca preparal, pipet tetes, erlemeyer, tabung reaksi, kompor listrik, autoclave, bunsen, pertridish, termometer.

3.2  Metoda Praktikum

3.2.1 Metode Penghitungan Total Koloni

 Sterilisasi Alat

Alat-alat seperti tabung reaksi, petridish, piper 1 ml, media kultur dan garam fisiologis disterilkan dalam autoclave pada suhu 121⁰C selama 15 menit dengan tekanan 15 lb (Volk dan Wheeler, 1988). Jarum ose disterilkan dengan membakarnya diatas api bunsen hingga membara, dibiarkan beberapa saat dan digunakan untuk setiap kali penggunaannya.

Pembuatan Media Agar (PCA)

Setelah semua peralatan dibersihkan dan disterilkan, maka PCA ditimbang dalam erlemeyer sebanyak 13,5 gram/200 ml aquades. Selanjutnya, larutan dihomongenkan dengan magnetic stirrer sampai homogen. Medium di panaskan diatas kompor listrik sampai mendidih dengan hati-hati agar medium tidak melimpah dari erlemeyer. Selanjutnya, dilakukan sterilisasi dengan autoclave pada suhu 121 ⁰C selama 15 menit, tekanan 15 lb. Terakhir medium dituangkan ke dalam petridish yang telah disterilkan dan dibiarkan membeku.

Jumlah Total Koloni Bakteri

Pelaksanaan perhitungan jumlah bakteri yang terdapat di dalam sayur, telur dan susu menggunakan Standat Plate Count dengan Spread method berdasarkan modifikasi metode Harley dan Prescott (1993) yaitu:

1.    Semua peralatan untuk menganalisis jumlah  bakteri disterilkan dalam autoclave selama 15 menit pada suhu 121ºC dengan tekanan 15 lb, terlebih dahulu dibungkus dengan kertas.

2.    Diambil sampel 1 gram dan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan garam fisiologis, sehingga diperoleh pengenceran 10^-¹.

3.    Dari campuran tersebut diambil 1 ml dan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml garam fisiologis, sehingga diperoleh pengencer 10^-².

4.    Dari pengenceran 10^-² diambil lagi 1 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi berikutnya yang telah berisi 9 ml garam fisiologis. Dengan demikian diperoleh pengenceran 10^-³.

5.    Pengenceran dilakukan seterusnya dengan metoda yang sama sampai pengenceran 10^-6.

6.    Pada pengenceran 10^-4, 10^-5 dan 10^-6, masing-masing diambil 1 ml dan dimasukkan kedalam media PCA dan diratakan.

7.    Inokulum disimpan dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 37ºC.

8.    Setelah 48 jam bakteri yang tumbuh dihitung dengan menggunakan alat Quebec Coloni Counter.

Perhitungan total koloni bakteri yaitu:

CFU/ml = Σ koloni  x    x 

3.2.2 Pewarnaan Gram

Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya  menggunakan alkohol . Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.

Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan kristal violet dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah kelebihan zat warna dicuci dengan air kemudian diberi larutan iodin dan dibiarkan sehingga terbentuk suatu kompleks antara violet kristal dan iodin. Olesan bakteri kemudian dicuci kembali dengan air mengalir. Kemudian dicuci dengan etanol dan dicuci kembali dengan air mengalir.

Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin dan diamkan. Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, kemudian diamati dibawah mikroskop. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

3.2.3 Uji Ketahanan Mikroba Terhadap Panas

Metoda yang digunakan unutuk uji ketahanan mikroba terhadap panas dilakukan pada tiga metoda yang berbeda yaitu pasteirusasi (suhu 60ºC), sterilisasi (100ºC) dan sterilisasi absolut (120ºC). Inokulum yang digunakan adalah bakteri yang berasal dari telur yang diperoleh dari pengujian total koloni pada telur.

IV.             HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1  Total Koloni Bakteri

Hasil penghitungan total koloni bakteri setelah diinkubasi selama 48 jam adalah sebagai berikut:

Tabel 4. Hasil Total Koloni Bakteri Pada Sayur, Telu dan Susu

Sampel	Jumlah Total Koloni
	10-4	10-5	10-6
Sayur	115	87	12
Telur	53	6	2
Susu	1	-	-

 

Sayur                           Telur                                        Susu

Gambar: Total Koloni Bakteri pada Sayur, Telur dan Susu

Pertumbuhan populasi koloni pada bahan sayur, telur di media koloni  pada media PCA diperoleh hasil populasi cukup banyak dimana PCA merupakan media pertumbuhan untuk semua mikroba yang ada pada bahan, hal ini disebabkan banyak faktor diantaranya kemungkinan adanya kontaminasi pada bahan tersebut. Sementara pada sampel susu hanya terdapat satu koloni bakteri hal ini disebabkan karena sampel susu yang digunakan adalah susu UHT, dimana kontaminasi terjadi mingkin saja pada saat kemasan dibuka hingga dilakukan penenceran.

Menurut Supardi (1999) factor intrinsic bahan pangan merupakan semua faktor yang mempengaruhi populasi mikroba yang berasal dari bahan makanan. Factor ini dapat meliputi sifat kimia atau komposisi, sifat fisik dan struktur makanan. Diantara faktor-faktor tersebut, misalnya aw (aktifitas air), komposisi nutrient, pH, potensial redoks, adanya bahan pengawet tambahan dan alami, lain sebagainya. Dalam hal ini misalnya adanya suatu mikroba yang terdapat di dalam bahan makanan, berupa daging akan berbeda dengan jenis mikroba yang dominan terdapat pada bahan makanan dari sayuran dan sayuran, karena kedua kelompok bahan makanan tersebut mempunyai  komposisi pH, potenseial redoks dan sifat-sifat lainnya yang berbeda. Disamping itu, mikroflora permukaan suatu jenis bahan pangan mungkin berbeda dengan mikroflora yang terdapat pada bagian dalam daging, mungkin bersifat aerobik atau anaerobik fakultatif, sedangkan pada bagian luarnya bersifat mikroba aerob.

Menurut Fardiaz (1988), bahwa pertumbuhan bakteri juga ditentukan oleh fase pertumbuhan. Jika suatu bakteri mempunyai waktu generasi 20 menit berarti suatu sel bakteri tersebut akan memperbanyak diri menjadi dua sel dalam waktu 20 menit. Jika sel tersebut diinkubasi di dalam suatu medium pada kondisi yang optimum untuk pertumbuhannya, maka dalam waktu 48 jam sel tersebut akan mengalami pembelahan sebanyak 48 (60)/20 kali atau 144 generasi. Pertumbuhan jasad renik di dalam kultur statis digambarkan sebagai sebagai suatu kurva seperti pada Gambar berikut  :    

                               Fase pertumbuhan statis

                                                                       Fase menuju kematian

                                      Fase pertumbuhan lama

                                   

                       

                                                                                             Fase kematian

                                               Fase logaritmik

   Fase adaptasi

                            

                          

 

                        Fase pertumbuhan awal

Gambar  Kurva pertumbuhan kultur jasad renik

4.2  Pewarnaan Gram

Hasil Praktikum pewarnaan gram pada bakteri yang mengkontaminasi telur yang diamati dibawak mikroskop dengan pembesaran 100 kali. Namun hasil dari pewarnaan ini memberikan warna yang tidak terlalu baik sehingga jenis bakteri gram positi dan garm negatif menjadi sulit untuk diamati. Berikut adalah hasil pewarnaan.

Gambar: Pewarnaan Gram pada Bakteri

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Dalam proses ini olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut dalam urutan yang telah ditentukan, yaitu ungu kristal, larutan yodium, alkohol (bahan pemucat) dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua kelompok. Salah satu diantaranya adalah bakteri gram positif, mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain adalah bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak berwarna merah.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :

1.      Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2.      Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3.      Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4.      Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya  menggunakan alkohol . Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

1.      Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

2.      Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam

3.      Lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

4.      Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

5.      Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

6.      Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

7.      Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

8.      Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

9.      Peka terhadap streptomisin

10.  Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

1.      Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

2.      Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

3.      Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

4.      Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

5.      Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

6.      Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

7.      Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

8.      Tidak peka terhadap streptomisin

9.      Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

4.3  Ketahan Mikroba Terhadap Panas

Hasil praktikum ketahanan mikroba terhadap panas yang dilakukan pada 3 metoda  dalam waktu 5 menit adalah sebagai berikut:

Tabel 5. Pengaruh Ketahanan Mikroba Terhadap Panas

Metoda	Jumlah total koloni
Pasteurisasi (60ºC)	Banyak
Sterilisasi (100ºC)	Negatif
Sterilisasi absolut (120ºC)	Negatif

Pengolahan dengan suhu tinggi dapat dilakukan dengan berbagai cara diantaranya adalah sterilisasi, pasteurisasi, dan blanching. (Kartasapoetra, 1989). Sterilisasi adalah membebaskan bahan dari semua mikroba dikarenakan  beberapa spora bakteri relatif lebih tahan terhadap panas. Selama proses sterilisasi dapat terjadi beberapa perubahan terhadap makanan yang dapat menurunkan mutunya. Oleh karena itu jumlah panas yang diberikan harus dihitung sedemikian rupa sehingga tidak merusak mutu makanan.(Winarno, 1980).

Total koloni yang tumbuh pada media PCA dengan proses pasteurisasi membuktikan bahwa bakteri pada sampel telur belum mati dengan susu pasteirusasi pada waktu 5 menit. Pasteurisasi adalah perlakuan panas pada suhu yang lebih rendah daripada sterilisasi, dan biasanya dilakukan pada suhu dibawah titik didih air. Pasteurisasi biasanya disertai dengan cara pengawetan yang lain, misalnya makanan yang dipasteurisasi kemudian disimpan dengan cara pendinginan. Bahan pangan yang dipasteurisasi seperti susu dapat disimpan selama 1 minggu didalam lemari es atau lebih tanpamengalami perubahan rasa yang nyata. Pasteurisasi biasanya dilakukan pada suhu 63 ^oC (145 ^oF) selama 30 menit. Kadang-kadang pasteurisasi juga dilakukan secara cepat yaitu 72 ^oC (161 ^oF) selama 15 detik. (Winarno, 1980).

Sementara itu, pada perlakuan panas sterilisasi yaitu 100ºC bakteri mati dalam waktu 5 menit, hal ini ditunjukkan denga tidak terdapatnya pertumbuhan total koloni pada media. Sterilisasi  yaitu penggunaan suhu panas untuk membunuh mikroba dengan suhu tinggi (121˚C selama 15 menit). Sterilisasi yang dapat dilakukan pada bahan pangan adalah sterilisasi komersial. Makanan yang disteril secara komersil berarti semua mikroba penyebab penyakit dan pembentuk racun dalam makanan telah dimatikan, demikian juga mikroba pembusuk (Winarno, 1982). Pemanasan dengan cara ini dapat dilakukan dengan menggunakan uap air panas bertekanan tinggi dan dapat dilakukan di dalam alat sterilizer, autoclave, atau retort. Uap air pada 5 psi (di atas tekanan udara 1 atm) bersuhu 109˚C, pada 10 psi bersuhu 115,5˚C dan pada 15 psi bersuhu 121,5˚C (Winarno, 1982).

V.                KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

• Pengujian total koloni bakteri dilakukan untuk mengetahui jumlah mikroorganisme yang mengkontaminasi suatu bahan. Dimana keadaan mikrorganisme akan mempengaruhi kondisi bahan pangan yang menyebab kerisakan sehingga pangan tidak dapat dikonsumsi.
• Keberdaan mikrorganisme dapat diindikasikan sebagai kebususkan pangan yang merupakan salah satu standar bahwa suatu produk masih dapat dikonsunsi atau tidak.
• Pewarnaan diferensial merupakan pewarnaan menggunakan lebih dari satu macam zat warna yang bertujuan untuk membedakan antar bakteri.Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.
• Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah.
• Ketahan mirkroorganisme terhadap perlakuan penggolahan seperti perlakuan panas tergantung pada metode yang digunakan. Dimana tidak semua jenis mikroorganisme dapat mati pada proses pasteurisasi. Serta ketahanan mikroba terhadap panas juga tergantung dari lama dari pemensan tersebut.

5.2 Saran

Ketersedian alat-alat laboratorim merupakan salah satu kendala dalam pelaksaan praktikum untuk memperoleh hasil yang lebih baik, sehingga hasil yang diperoleh tidak memuaskan.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2011. Mikrobiologi pangan dan Lingkungan. http://www.google.com

Anonym.  2011.  Mengenal Media Pertumbuhan Mikroba.  http://rachdie.blogsome.com/2006/10/18/mengenal-media-pertumbuhan-mikrobial/

Astawan dan Made.  2007.  Wapadai Bakteri Patogen pada Makanan
file:///D:/Download/mikro/ptofriend.aspx.htm

Djaafar. 2007. Cemaran Mikroba pada Produk Pertanian, Penyakita yang Ditimbulkan dan Pencegahannya.http://pustaka-deptan.go.id. [30 Juni 2009].

Fardiaz,  S.  1992.    Mikrobiologi   Pangan 1.   Penerbit       PT.   Gramedia    Pustaka Utama, Jakarta.

Fardiaz, S. 1993.  Analisis   Mikrobiologi   Pangan.   Penerbit   PT.     Raja    Grafindo Persada, Jakarta.

Madigan et al., 1995.   Biology   of   microorganisms,  Prentice   Hall, Inc., New Jersey.

Metting, F.B. (1993).   Soil   Microbial   Ecology.    Applications   in Agriculture    and Environment   Management.Marcel Dekker. Inc. NY

Nurwantoro    dan   A.   S.   Djarijah.1999.   Mikrobiologi     Pangan    Hewani - Nabati. Penerbit Kanisius, Jakarta.

Pelczhar. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi 1. Jakarta. UI Press.

Muchtadi dan Sugiono. 1992. Imu Pengetahuan Bahan Pangan. Direktorat Jenderal Pendidikan tinggi Pusat Antara Universitas Pangan dan gizi IPB: Bogor.

Muchtadi, Deddy. 2005. Keamanan Pangan. Department of Food Science and Technology, IPB: Bogor.

Saparinto, Cahyo dan Diana Hidayati. 2006. Bahan Tambahan Pangan. Kanisius: Yogyakarta.

Winarno, F.G;  S. Fardiaz dan D. Fardiaz. 1980. Pengantar Teknologo Pangan. PT Gramedia : Jakarta.